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TUhjnbcbe - 2024/9/1 17:34:00
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相信做qPCR的研友经常会碰到以下令人抓狂的时刻:

三个重复的Cqmax和Cqmin能差到两个循环;提的样本中总是含有很多PCR抑制剂,导致Cq值偏大;极低丰度样本的Cq值总是游走在40和N/A边缘,让人崩溃;绝对定量时需要的标准品既没有商品化,自己制备起来又很费时费力……

数不胜数的坑,等着有人来跳……

那真的束手无策了吗?

其实归结起来,qPCR实验中碰到的难题无非是重复性差、扩增易受抑制、灵敏度低和需要标准曲线等,接下来介绍的DigitalPCR(数字PCR)就可以完美的解决这些问题!

数字PCR是什么?

数字PCR是一种新型的核酸(DNA、cDNA或RNA)定量技术,它采用有限稀释的方法,使用泊松分布分析数据从而得到靶标的绝对拷贝数浓度。

数字PCR实验中,一个完整的qPCR反应体系(包括模板、DNA聚合酶、引物、探针等)被分隔为若干个(通常数万个到几百万个)独立的反应区间(纳升级体积),经过PCR扩增后,包裹有靶标DNA的反应区间会发出荧光信号,标记为阳性;反之为阴性。

最后根据阴性反应区间的比例经过泊松分布计算得到靶标DNA的拷贝数浓度。

图片来源:Analyticalchemistry

其实数字PCR不算是新技术了,它的原型可以追溯到年。Sykes等报道了基于样品有限稀释和泊松分布数据处理的巢式PCR定量技术,并提出了数字PCR的构想[1]。

年,Vogelstein和Kinzler采用96孔板系统发展了微升级的PCR扩增方法,用于结肠癌的突变基因ras的定量分析[2],使数字PCR的应用实践成为了可能。

后来芯片蚀刻技术和微流控技术的发展,使得数字PCR真正有了用武之地。

图片来源:文章截图

数字PCR的优势

相较于qPCR,数字PCR有以下优势:

1.真正的绝对定量,无需标准品和标准曲线;

2.不再像qPCR那样严重依赖于扩增效率,对PCR抑制耐受程度高,模板适用度广;

3.更高的分辨率,能够区分1.1倍的浓度差异,适合高拷贝数的CNV(16copyvs18copy)实验;

4.更高的灵敏度,可以检测到单拷贝的靶标,适合单细胞基因表达等研究。

5.重复性好,intra-assay和inter-assay的CV较qPCR低[3]。

数字PCR实验的操作

数字PCR的实验无需太过复杂的操作,但需要相关设备的辅助才可以实现。数字PCR从partition制备方式上分为芯片式和微滴式,操作大同小异,一般分为以下几步:

1.配置ReactionMix。包含引物、荧光探针或者染料、模板和DNA聚合酶,不同厂家对体积要求也不一,一般15-25μl。2.Partition分隔。通过芯片或者微流控设备将配好的体系处理成-个partition,不同的厂家其partition的数量也不同。3.PCR扩增。使用普通的PCR循环仪或者平板扩增系统将生成的partition进行扩增。4.读取数据。使用CCD拍照方式或者流式细胞术技术对partition进行信号读取,最后软件根据阴性的partition比例计算得到靶标的浓度,单位是copy/μl。

数字PCR的应用

目前数字PCR的应用已经非常成熟,通俗的讲,qPCR能做的,数字PCR轻松加愉快,qPCR做不到的,数字PCR也可以胜任。

SNP方面,与疾病的分子标志物检测相关的文献多如过江之鲫,尤其是非小细胞肺癌相关的EGFR突变。Oxnard等使用数字PCR技术监测血浆中EGFR敏感突变和耐药性突变(TM)[4]。

基因表达方面,已经深入到单细胞的水平。Albayrak等使用数字PCR研究单细胞基因的转录组丰度和蛋白组丰度的相关性[5],其中用到的邻位连接技术PLA很有新意,将低丰度蛋白的检测转化为相对容易的DNA检测。

CNV方面,数字PCR可以用于检测皮肤中体细胞的拷贝数嵌合现象[6]。

当然也有其他方向的各种新奇应用,比如四种不同RNA剪接体的同时检测[7],将T4单细胞包进partition中进行HIV病毒库的检测[8]等。

套用句过时了的话:只有你想不到的,没有数字做不到的。

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