相信做qPCR的研友经常会碰到以下令人抓狂的时刻：
三个重复的Cqmax和Cqmin能差到两个循环；提的样本中总是含有很多PCR抑制剂，导致Cq值偏大；极低丰度样本的Cq值总是游走在40和N/A边缘，让人崩溃；绝对定量时需要的标准品既没有商品化，自己制备起来又很费时费力……
数不胜数的坑，等着有人来跳……
那真的束手无策了吗？
其实归结起来，qPCR实验中碰到的难题无非是重复性差、扩增易受抑制、灵敏度低和需要标准曲线等，接下来介绍的DigitalPCR（数字PCR）就可以完美的解决这些问题！
数字PCR是什么？
数字PCR是一种新型的核酸（DNA、cDNA或RNA）定量技术，它采用有限稀释的方法，使用泊松分布分析数据从而得到靶标的绝对拷贝数浓度。
数字PCR实验中，一个完整的qPCR反应体系（包括模板、DNA聚合酶、引物、探针等）被分隔为若干个（通常数万个到几百万个）独立的反应区间（纳升级体积），经过PCR扩增后，包裹有靶标DNA的反应区间会发出荧光信号，标记为阳性；反之为阴性。
最后根据阴性反应区间的比例经过泊松分布计算得到靶标DNA的拷贝数浓度。
图片来源：Analyticalchemistry其实数字PCR不算是新技术了，它的原型可以追溯到年。Sykes等报道了基于样品有限稀释和泊松分布数据处理的巢式PCR定量技术，并提出了数字PCR的构想[1]。
年，Vogelstein和Kinzler采用96孔板系统发展了微升级的PCR扩增方法，用于结肠癌的突变基因ras的定量分析[2]，使数字PCR的应用实践成为了可能。
后来芯片蚀刻技术和微流控技术的发展，使得数字PCR真正有了用武之地。
图片来源：文章截图数字PCR的优势
相较于qPCR，数字PCR有以下优势：
1.真正的绝对定量，无需标准品和标准曲线；
2.不再像qPCR那样严重依赖于扩增效率，对PCR抑制耐受程度高，模板适用度广；
3.更高的分辨率，能够区分1.1倍的浓度差异，适合高拷贝数的CNV（16copyvs18copy）实验；
4.更高的灵敏度，可以检测到单拷贝的靶标，适合单细胞基因表达等研究。
5.重复性好，intra-assay和inter-assay的CV较qPCR低[3]。
数字PCR实验的操作
数字PCR的实验无需太过复杂的操作，但需要相关设备的辅助才可以实现。数字PCR从partition制备方式上分为芯片式和微滴式，操作大同小异，一般分为以下几步：
1.配置ReactionMix。包含引物、荧光探针或者染料、模板和DNA聚合酶，不同厂家对体积要求也不一，一般15-25μl。2.Partition分隔。通过芯片或者微流控设备将配好的体系处理成-个partition，不同的厂家其partition的数量也不同。3.PCR扩增。使用普通的PCR循环仪或者平板扩增系统将生成的partition进行扩增。4.读取数据。使用CCD拍照方式或者流式细胞术技术对partition进行信号读取，最后软件根据阴性的partition比例计算得到靶标的浓度，单位是copy/μl。
数字PCR的应用
目前数字PCR的应用已经非常成熟，通俗的讲，qPCR能做的，数字PCR轻松加愉快，qPCR做不到的，数字PCR也可以胜任。
SNP方面，与疾病的分子标志物检测相关的文献多如过江之鲫，尤其是非小细胞肺癌相关的EGFR突变。Oxnard等使用数字PCR技术监测血浆中EGFR敏感突变和耐药性突变（TM）[4]。
基因表达方面，已经深入到单细胞的水平。Albayrak等使用数字PCR研究单细胞基因的转录组丰度和蛋白组丰度的相关性[5]，其中用到的邻位连接技术PLA很有新意，将低丰度蛋白的检测转化为相对容易的DNA检测。
CNV方面，数字PCR可以用于检测皮肤中体细胞的拷贝数嵌合现象[6]。
当然也有其他方向的各种新奇应用，比如四种不同RNA剪接体的同时检测[7]，将T4单细胞包进partition中进行HIV病*库的检测[8]等。
套用句过时了的话：只有你想不到的，没有数字做不到的。